己酮可可碱对冷冻前后精子的影响

近年来男性不育发病率则逐年上升［１］。治疗男性不育，提高精子质量，已经成为目前生殖研究的重中之重［２３］。随着体外受精技术的日渐成熟，已有不少研究通过体外精子优选和化学试剂体外刺激精子，从而有效提高精子的活力和受精能力，最终提高人工授精和体外受精胚胎移植的妊娠率［４］。己酮可可碱（ｐｅｎｔｏｘｉｆｙｌｌｉｎｅ，ＰＦ）属于甲基黄嘌呤类化合物，可以改善少弱精子的活力［５］。通过短时间用ＰＦ处理精子，可以有效提高精子活动率和精子运动能力［６］。但随着ＰＦ处理精子时间的延长，精子膜的完整性明显降低，增加了精子的死亡率［７］。同时过高的ＰＦ浓度也会造成精子功能减退及与透明带结合能力的丧失。因此，出于安全性考虑ＰＦ在体外提高精子活动率和精子运动能力的特性，只能在低浓度、短时间下应用［８９］。

本 文 旨 在 探 讨 不 同 浓 度 Ｐ Ｆ 较 短 作 用 时 间 下 对 精 子 冷 冻 前 后 活 力 和 复 苏 率 的 影 响 及 其 在 对 精 子 具 体 运 动 功 能 参 数 的 影 响 ， 确 定 Ｐ Ｆ 的 作 用 浓 度 和 作 用 时 间 ， 寻 找 出 一 种 采 用 Ｐ Ｆ 提 高 精 子 复 苏 率 和 精 子 活 力 的 方 法 ， 以 期 为 人 工 授 精 和 体 外 受 精 技 术 的 研 究 和 实 践 提 供 依 据 ， 同 时 也 为 精 子 的 体 外 处 理 技 术 的 发 展 提 供 参 考

对 象 与 方 法 １  研 究 对 象 ： 选 择 ２ ０ １ ９ 年 ４ 月 — １ ２ 月 ，精 子 库 健 康 体 检 者 的 精 液 标 本 作 为 研 究 对 象 ， 所 有 研 究 对 象 均 依 据 第 五 版 世 界 卫 生 组 织 （ Ｗ Ｈ Ｏ ） 精 子 的 诊 断 标 准 ， 经 医 院 伦 理 委 员 会 批 准 。 纳 入 标 准 ： （ １ ） 年 龄 ≥ ２ ０ 岁 且 ≤ ４ ５ 岁 ； （ ２ ） 血 常 规 、 肝 肾 功 能 正 常 ； （ ３ ） 获 得 知 情 同 意 ， 签 署 知 情 同 意 书 。 排 除 标 准 ： （ １ ） 合 并 心 肺 、 肝 肾 功 能 严 重 异 常 者 ； （ ２ ） 精 神 疾 病 者 ； （ ３ ） 传 染 病 患 者 ； （ ４ ） 有 遗 传 病 家 庭 史 或 遗 传 病 的 。 最 终 纳 入 了 ３ ０ 例 健 康 体 检 者 ， 年 龄 ２ １ ～ ３ ０ 岁 ， 平 均 （ ２ ４  １ ２ ± ３  ８ ２ ） 岁 ； 职 业 ： 大 学 在 校 生 １ １ 例 ， 公 司 白 领 ７ 例 ， 公 务 员 ７ 例 ， 其 他 ５ 例 ； ２  标 本 处 理 和 观 察 指 标 ： （ １ ） 冷 冻 前 ： 所 有 研 究 对 象 均 禁 欲 ３ ～ ７ ｄ 后 试 验 。 采 用 手 淫 法 取 得 全 份 新 鲜 精 液 标 本 ， 将 其 放 置 于 ３ ７ °C 条 件 下 ， 恒 温 孵 育 箱 中 ３ ０ ｍ ｉ ｎ 左 右 ， 完 全 液 化 后 备 检 。 将 精 液 分 装 到 ５ 组 冷 冻 管 中 ， 每 管 ０  ２ ｍ Ｌ ， 其 中 的 ４ 组 分 别 加 入 配 有 Ｐ Ｆ 的 保 护 液 ， 使 其 终 浓 度 分 别 为 ０  ６ ｍ ｍ ｏ ｌ ／ Ｌ 、 １  ２ ｍ ｍ ｏ ｌ ／ Ｌ 、 ２  ４ ｍ ｍ ｏ ｌ ／ Ｌ 、 ３  ６ ｍ ｍ ｏ ｌ ／ Ｌ ， 充 分 混 合 ， 对 照 组 加 入 等 体 积 的 保 护 液 。 在 孵 育 １ ０ ｍ ｉ ｎ 后 ， 用 计 算 机 辅 助 精 子 分 析 仪 （ ｃ ｏ ｍ ｐ ｕ ｔ ｅ ｒ  ａ ｉ ｄ ｅ ｄ ｓ ｐ ｅ ｒ ｍ ａ ｎ ａ ｌ ｙ ｓ ｉ ｓ ， Ｃ Ａ Ｓ Ａ ） 检 测 精 子 各 项 参 数 ， 每 份 标 本 ， 观 察 精 子 数 ≥ ２ ０ ０ 个 ， 观 测 ３ 个 视 野 ， 测 定 精 子 浓 度 和 活 力 不 同 浓 度 Ｐ Ｆ 作 用 下 的 精 子 活 力 ［ 前 向 运 动 型 （ ｐ ｒ ｏ ｇ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｖ ｅ ， Ｐ Ｒ ） 、 非 前 向 运 动 型 （ ｎ ｏ ｎ  ｐ ｒ ｏ ｇ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｖ ｅ ， Ｎ Ｐ ） 、 完 全 不 动 型 （ ｉ ｍ ｍ ｏ ｔ ｉ ｌ ｅ ， Ｉ Ｍ ） ］ 变 化 。 并 进 行 活 力 检 测 及 精 子 运 动 功 能 检 测 ［ 包 括 精 子 直 线 速 度 ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｇ ｈ ｔ ｌ ｉ ｎ ｅ ｖ ｅ ｌ ｏ ｃ ｉ ｔ ｙ ， Ｖ Ｓ Ｌ ） 、 曲 线 速 度 （ ｃ ｕ ｒ ｖ ｉ ｌ ｉ ｎ ｅ ａ ｒ ｖ ｅ ｌ ｏ ｃ ｉ ｔ ｙ ， Ｖ Ｃ Ｌ ） 、 摆 动 性 （ ｗ ｏ ｂ ｂ ｌ ｅ ， Ｗ Ｏ Ｂ ） 、 侧 摆 幅 度 （ ａ ｍ ｐ ｌ ｉ ｔ ｕ ｄ ｅ ｏ ｆ ｌ ａ ｔ ｅ ｒ ａ ｌ ｈ ｅ ａ ｄ · ５ ７ · 中 国 生 育 健 康 杂 志 ２ ０ ２ ４ 年 第 ３ ５ 卷 第 １ 期 ｈ ｔ ｔ ｐ ： ／ ／ ｃ ｊ ｒ ｈ ． ｂ ｊ ｍ ｕ ． ｅ ｄ ｕ ． ｃ ｎ ｄ ｉ ｓ ｐ ｌ ａ ｃ ｅ ｍ ｅ ｎ ｔ ， Ａ Ｌ Ｈ ） 、 直 线 性 （ ｌ ｉ ｎ ｅ ａ ｒ ｉ ｔ ｙ ， Ｌ Ｉ Ｎ ） ］ 。 （ ２ ） 冷 冻 后 ： 使 用 Ｇ ｒ ａ ｎ ｔ Ｅ Ｆ ６ ０ ０ 程 序 降 温 仪 冷 冻 精 子 ， 按 照 设 置 好 的 精 子 冷 冻 曲 线 ， 进 行 冷 冻 ， 当 温 度 达 到 － ８ ０ °C 时 ， 转 移 到 液 氮 中 ， 在  １ ９ ６ °C 下 保 存 ２ ４ ｈ ， 然 后 进 行 复 苏 操 作 。 将 精 液 标 本 冷 冻 管 从 液 氮 中 取 出 ， 迅 速 置 于 ３ ７ °C 水 浴 中 。 保 温 复 苏 １ ０ ｍ ｉ ｎ 后 ， 取 出 备 检 。 ３ ． 统 计 学 方 法 ： 各 组 数 据 以 珋 ｘ ± ｓ 表 示 ， 采 用 统 计 学 软 件 Ｓ Ｐ Ｓ Ｓ ２ ２  ０ 进 行 数 据 处 理 ，