在器官培养过程中评估青春期前男孩的新鲜和冷冻睾丸组织作为体外精子发生的策略

研究问题： 器官培养方法是否可以应用于新鲜和冷冻保存的青春期前睾丸组织作为体外精子发生的策略？

总结答案： 虽然在体外没有实现精子发生的诱导，但新鲜和冷冻保存的睾丸组织中睾丸结构、内分泌功能和精原细胞增殖均得以维持。

已知的是： 睾丸活检的冷冻保存越来越多地作为青春期前癌症患者的生育力保存策略。所提出的恢复生育能力的实验方法之一是器官培养方法，该方法在小鼠模型中成功地允许睾丸活检中的精子在体外发育。然而，在这种器官培养系统中，人类青春期前睾丸组织的完整精子发生尚未得到证实。

研究设计、规模、持续时间： 从 9 名被诊断患有癌症（年龄范围为 6 至 14 岁）的青春期（前）男孩中收集睾丸组织，这些男孩在治疗前为了保留生育能力而入院。睾丸活检要么立即进行培养，要么首先使用受控慢速冷冻方案进行冷冻保存，并在培养前解冻。睾丸碎片的器官培养在两种不同的培养基中进行，最长持续时间为 5 周，以体外早期细胞事件（活力、减数分裂和体细胞分化）为目标。

参与者/材料、设置、方法： 将新鲜和冷冻解冻的睾丸碎片 (1-2 mm3) 在气液界面（34°C，5% CO2）下在含有 10-7 M 褪黑激素的最低必需培养基 α + 10% 敲除血清替代培养基中培养和 10-6 M 视黄酸，补充或不补充 3 IU/L FSH/LH。每周通过生殖细胞发育的组织学评估和精原细胞的免疫组织化学鉴定（使用 MAGEA4）、精原细胞和支持细胞的增殖状态（使用增殖细胞核抗原 [PCNA]）、管内细胞凋亡（使用通过末端脱氧核苷酸转移酶介导的 dUTP 缺口末端标记）和支持细胞成熟（使用抗苗勒管激素 [AMH] 与雄激素受体 [AR]）。此外，间质细胞

主要结果和机会的作用： 新鲜或冷冻保存的青春期前睾丸碎片都无法在我们的器官培养系统中启动精子发生。尽管如此，我们的数据表明，新鲜和冷冻保存的睾丸碎片在所描述的器官培养条件下具有相当的功能，这反映在任何每周评估的功能参数均不存在显着差异。此外，在培养新鲜和冷冻保存的人类睾丸碎片时，两种测试培养基之间没有发现显着差异。尽管精原细胞在所有培养条件下都能存活并保持增殖状态，但在培养期间观察到精原细胞数量显着减少（P≤0.001），这通过增殖活性的综合降低（P≤0.001）来证明是合理的。001) 并增加管内细胞凋亡 (P ≤ 0.001)。我们观察到支持细胞增殖活性短暂增加，AMH 表达丧失（P ≤ 0.001），但没有诱导 AR 表达。整个培养期间所有条件下睾酮产量的增加表明，间质细胞内分泌功能在体外被成功刺激（P ≤ 0.02）。

局限性，谨慎的原因： 虽然在本研究中不明显，但我们不能排除如果建立了确保人类睾丸碎片完整生精的优化培养方法，则可能会发现新鲜组织和冷冻保存组织之间功能或生精效率的差异。

研究结果的更广泛影响： 目前无法从冷冻保存的人类睾丸碎片在体外启动精子发生，应将其纳入对接受睾丸组织冷冻保存以保留生育能力的患者的咨询中。